|
Mô tả quy trình CN/TB:
- Từ năm 1987, lần đầu tiên trong cả nước, phòng thí nghiệm Arbovirút-Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã xây dựng kỹ thuật Mac-Elisa dùng chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) phỏng theo qui trình của Trung tâm phòng chống dịch (CDC) tại Puerto và Colorado Hoa Kỳ và đã đưa kỹ thuật này vào sử dụng từ 1998 đến nay.
- SXHD là bệnh dịch gây ra do muỗi Aedes aegypti truyền cho người. Virút gây bệnh này là 4 typ virút Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3, và DEN-4) có kháng nguyên rất gần giống nhau, nhưng nhiễm trùng do một týp gây ra, lại không bảo vệ các týp khác, do đó người sống trong vùng lưu hành dịch sẽ lần lượt mắc cả 4 týp virút DEN và có biểu hiện lâm sàn nặng là sốc gây tử vong. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO/CDC/(DEN)/IC/2000.1), tính đến nay số người mắc sốt DEN và SXHD trên thế giới đã tăng lên khủng khiếp trong 4 thập niên qua. Hiện nay dịch bệnh này đã xuất hiện trên 100 nước toàn thế giới và đe doạ sức khoẻ của trên 2,5 tỷ người ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong thập niên 1950 chỉ có khoảng 908 ca SXHD báo cáo mỗi năm.
NGUYÊN LÝ:
Kháng thể IgG để kháng IgM người gắn lên bảng nhựa. Tiếp theo là huyết thanh bệnh nhân, kháng nguyên đã biết và kháng thể gắn enzym đặc hiệu cho kháng nguyên, và cuối cùng là cơ chất cho cộng hợp sử dụng. Đây là phản ứng hấp phụ miễn dịch enzym thu bắt kháng thể IgM đặc hiệu cho virút Dengue.
TRANG THIẾT BỊ:
| Multipipet: 5-50 ul |
Labsystem, Nichiryo |
| Multipipet: 50-200 ul |
Labsystem, Nichiryo |
| Pipetman 10, 100, 1000 ul |
Nichiryo, Gilson |
| Máy đọc vi bảng nhựa |
Bio-tek Elx 800 |
| Máy rửa vi bảng nhựa |
Sanofi PW 41 |
| Máy ủ 37oC |
|
| Bảng nhựa 96 giếng đáy phẳng Maxisorp |
Nunc |
| Đầu côn nhựa 10 ul. 200 ul. 1000 ul |
|
VẬT LIỆU VÀ SINH PHẨM-HOÁ CHẤT
* Dung dịch đệm Carbonate pH 9.6
| Na2CO3 |
1.59g |
| NaHCO3 |
2.93g |
| Nước cất vừa đủ |
1000 ml |
Lọc vô trùng bằng lọc 0,2nm. Bảo quản 4oC trong 1 năm.
* Dung dịch đệm Phosphate 20X (PBS)
| Na2HPO4 |
91.27g |
| NaCl |
640g |
| Na2HPO4 |
72.8g |
| KCl |
16g |
| KH2PO4 |
11.2g |
| Nước cất vừa đủ |
4.000ml |
Lọc vô trùng bằng lọc 0,2nm. Bảo quản ở 4oC trong 1 năm.
* 1XPBS
| PBS 20X |
50ml |
| Nước cất vừa đủ |
950ml |
| Bảo quản ở 4oC trong một năm |
|
* Dung dịch PBS/5% sữa không béo/0.5% Tween 20
| sữa không béo |
25g |
| Tween 20 |
2.5ml |
| PBS 1X vừa đủ |
500ml |
| Bảo quản ở 4oC trong một tuần |
|
* Dung dịch PBS/0.05% Tween 20
| Tween 20 |
2ml |
| PBS 1X vừa đủ |
4.000ml |
* Tween 20 (Sigma P1339)
* H2SO4 1N
* 3, 3', 5, 5' tetramethylbenzidine base (TMB)/Peroxyde (KPL 5065-02). Bảo quản ở 4oC trong 1 năm.
* IgG người kháng IgM người tinh chế ái lực KPL 01-03)
- Kháng IgM người 1mg
- Nước cất-Glycerine (1:1) 2ml
- Hiệu giá chuẩn độ trước khi dùng: 1/500.
Chia nhỏ 40micron vào ống nghiệp eppendorf 0.5ml. Bảo quản ở -20oC trong 1 năm.
* Kháng nguyên chế từ não chuột ổ nhiễm chiết xuất bằng sucrose-acetone (Viện Pasteur Tp. HCM).
- Hiệu giá chuẩn độ trước khi dùng
Chia nhỏ 200micron lít vào ống nghiệm eppendorf 1.5ml. Bảo quản ở -20oC.
* Cộng hợp 6B6C-1 đặc hiệu nhóm flavivius gắn peroxidase (CDC).
6B6C-1 đặc hiệu nhóm flavivius gắn peroxidase 0.5mg
Nước cất 2ml
Hiệu giá chuẩn độ trước khi dùng
Chia nhỏ 20micron lít vào ống nghiệm eppendorf 0.5ml. Bảo quản ở -20oC
* Sữa không béo. Bảo quản ở 4oC trong 1 năm
QUI TRÌNH PHẢN ỨNG:
1. Gắn bảng nhựa:
IgG để kháng IgM người (chuỗi micron) pha loãng 1:500 trong dung dịch đệm carbonate, Ph9,6.
Cho 100 micron lít/giếng, ủ qua đêm ở 4oC
Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%
2. Phủ bảng nhựa bằng dung dịch PBS-sữa không béo 5%-Tween 20 0.05%
Cho 300 micron lít/giếng. Ủ 1 giờ ở 37oC
Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%
3. Huyết thanh thử nghiệm, chứng dương và âm:
Huyết thanh thử nghiệm, chứng dương và âm:
Huyết thanh bệnh nhân pha loãng: 1:1000 (hoặc dịch não tuỷ không pha loãng) trong dung dịch PBS-sữa không béo 1%. Cho 100micron lít/giếng. Ủ trong 1 giờ 37oC trong buồng ẩm.
Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%
4. Kháng nguyên:
Pha loãng kháng nguyên trong dung dịch PBS-sữa không béo 1% theo hiệu giá chuẩn độ trước. Cho 100micron lít/giếng. Ủ 2 giờ ở 37oC hoặc qua đêm ở 4oC
Rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.05%
5. Cộng hợp:
Pha loãng kháng thể đơn dòng 6B6C-1 kháng flavirút gắn HRPO 1:2.000 trong PBS-sữa không béo 1% theo hiệu giá đã chuẩn độ trước. Cho 100micron lít/giếng. Ủ 1 giờ ở 37oC trong buồng ẩm.
Rửa 7 lần bằng dung dịch PBS-Tween 20 0.0.5%
6. Cơ chất TMB-H2O2 (thể tích 1:1) (để ở nhiệt độ phòng 15 phút trước khi dùng):
Cho 100micron lít/giếng. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng trong tối. Không rửa
7. Ngừng phản ứng bằng H2SO4 1N:
Cho 50micron lít/giếng
Đọc kết quả bằng máy đọc Elisa ở bước sóng kép 450nm/620nm
CÁCH TÍNH KẾT QUẢ:
Kết quả thử nghiệm xem như dương tính nếu tỷ lệ mật độ quang (OD) của thử nghiệm và chứng âm là >2.3
Ngưỡng phản ứng = 2.3 x OD chứng âm
OD mẫu ≥ OD ngưỡng. Dương tính
OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính
TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ KIỂM ĐỊNH:
CV > 10% mẫu lặp lại
OD chứng dương < 0.6
OD chứng âm > 0.2
Mẫu huyết thanh thử nghiệm nên lấy sau khởi sốt 5 ngày
- Công suất: (tính theo ca) 45 ca/bộ sinh phẩm
- Tiêu chuẩn đạt được: TCVN, TCNN
- Các chỉ tiêu kinh tế-kỹ thuật khác:
+ Độ nhạy cảm: 98%
+ Độ đặc hiệu: 100%
+ Giá trị tiên lượng dương: 99%
+ Giá trị tiên lượng âm: 95%
+ Hạn dùng: 6 tháng
|